你還搞不清楚病毒載體的用法？

基因表達載體是廣大科研人員普遍需要的研究工具，而病毒載體憑借其優(yōu)良效能則越來越成為最shou歡迎、也最為普遍的基因表達載體。然而病毒載體也分為好幾類，不同實驗類型、不同研究目的、不同“受體”性質需要我們準確評估與選擇。因此，詳細了解不同病毒載體的相關知識是我們科研人員必須掌握的。本文詳細介紹了常見病毒載體的原理、特點和適用范圍。

一、慢病毒載體慢病毒（Lentivirus）屬于逆轉錄病毒的一種，有由于其感染潛伏期較長，臨床癥狀發(fā)展緩慢，被稱為慢病毒。而慢病毒載體則是在慢病毒的基礎上改變重組其構成原件，進而在去除其生物危害性的同時，利用其高感染等性能表達目的基因。人類免疫缺陷病毒（HIV）是常見的慢病毒載體改造原型。如下以HIV中最為常見的HIV-1型：

HIV-1為雙鏈RNA病毒，主要組分包含三種重要病毒核心基因：gag（編碼結構蛋白或稱為核心蛋白），pop（編碼復制相關酶類），env（編碼包膜糖蛋白）；調節(jié)基因：tat（轉錄控制）和rev（表達調節(jié)）；四個輔助基因：vif、vpr、vpu、nef（作為毒力因子參與宿主細胞的識別和感染）；兩端為長末端重復序列LTR (內含復制所需的順式作用元件)。

第一代慢病毒載體為雙質粒系統(tǒng)，基本保留了HIV的所有組件，產毒滴度低，復制缺陷，且存在產生復制能力的活性HIV病毒的可能；第二代慢病毒載體為三質粒系統(tǒng)，分為包裝質粒、包膜質粒和載體質粒，其中使用水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因替代env基因，拓寬了病毒的感染宿主細胞范圍，雖然三質粒降低了病毒重組的可能，但是由于其依然保留HIV大部分附屬基因，產生活性HIV依然存在可能；第三代慢病毒載體則去除了HIV病毒所有輔助序列，只保留核心的3個基yin（gag、pol、rev），病毒RNA不能轉錄，故意外重組的可能性很低；第四代慢病毒載體為四質粒系統(tǒng)，即將病毒核心基因分散在多個質粒中(pGag/Pol、pRev、pVSV-G和載體質粒)，同時去除tat，故病毒重組、產生活性病毒的可能進一步降低，同時四質粒系統(tǒng)中的載體質粒中可以包含可誘導基因，使得該基因表達系統(tǒng)可以條件性調控。

慢病毒載體感染能力強、且宿主廣泛（分裂和非分裂細胞）；能夠整合進宿主DNA且篩選后穩(wěn)定遺傳；表達潛伏期短，一般細胞24h-48h、體內96小時可表達；慢病毒載體可以插入組織特異性啟動子或增強子；慢病毒攜帶基因的長度大致無5kb以內。由于慢病毒依然是HIV來源，自然宿主是人，依然存在潛在的生物毒性，故操作時避免直接接觸人體。慢病毒載體適合常見類型的體外研究（細胞），包括過表達、敲除、敲低都基因干預操作，但慢病毒載體不適合于體內研究，因為其滴度不能夠滿足體內用量且免疫原性較強。

二、腺病毒載體腺病毒（Adenovirus）是一種線性無包膜的雙鏈DNA病毒，腺病毒的衣殼結構可以分為五鄰體和六鄰體兩部分，腺病毒的基因組主要包括病毒DNA復制前期的Ela、Elb、E2a、E2b、E3、E4（編碼病毒調節(jié)蛋白）和DNA復制后期的Ll～L5（編碼病毒結構蛋白），以及兩端的反向重復序列，ITRs（包裝所必需的順式作用元件）。

在天然腺病毒（主要是人5型腺病毒）的基礎上改造而得的腺病毒載體，其基因攜帶量增加，感染效率增加，且生物毒性降低。第一代腺病毒載體是刪除Ela、Elb基因的復制缺陷病毒，其復制必須在表達E1蛋白的細胞中，病毒滴度高且穩(wěn)定，不整合宿主基因組，但包裝量少（約為4.5kb），免疫原性強；第二代腺病毒載體進一步刪減病毒原有基因，在減少免疫原性和細胞毒性的同時，進一步提高載體容量，可以達到14kb，但是病毒滴度較低；第三代腺病毒載體則只保留了ITRs和包裝信號序列，因此其攜帶外源基因容量更大，約36 kb，但由于病毒包裝基因必須基因被刪除，第三代腺病毒載體工作組裝需要輔助病毒（表達腺病毒裝配必須基因），第三代腺病毒載體容量大，免疫原性低，但是量產困難，存在輔助病毒污染風險。

腺病毒感染力強、宿主范圍廣（分裂和非分裂細胞），表達迅速（24h-48h）且表達量高，包裝容量大，但腺病毒不能整合入宿主基因組內，規(guī)避了整合入宿主基因組的生物風險，安全的同時也形成了細胞分裂過程中不能均等分配給子細胞。腺病毒載體適合一般體外實驗，使用細胞類型較多，免疫原性較強，不適合體內實驗。

三、腺相關病毒腺相關病毒（Adeno-associated virus，AAV）是無包膜單鏈線狀DNA 缺陷型病毒，外包二十面體衣殼蛋白，基因組包括兩端的反向重復序列ITR（包含復制和包裝所需的唯1順式作用元件），中間的兩個核心基因：Rep 基因（編碼參與病毒復制、包裝和基因整合的蛋白），Cap（編碼結構蛋白VP1、VP2、VP3）。AAV為復制缺陷病毒，不能獨立存在，其復制增殖需要輔助病毒作用。衣殼蛋白不同的AAV病毒，對組織器官的親和力不同，形成各種AAV血清型：如AAV1較易感染骨骼肌，AAV6較易感染肺部，AAV8則親嗜肝臟，AAV9則為神經和外周組織（見后表）。

腺相關病毒載體（重組腺相關病毒載體, rAAV）的發(fā)展同樣在天然AAV的基礎上不斷優(yōu)化改進。最早采用重組載體質粒、目的基因質粒、輔助質粒、腺病毒共轉染細胞，步驟多、產率低、風險高；隨后采用目的基因載體、AAV基因載體(rep／cap)、輔助質粒（包含E1a、E1b、E2a、E4、VA等能完成腺病毒相似輔助功能的基因元件）共轉染細胞，但包裝效率低，生物風險高；Ad/AAV嵌合載體、輔助質粒感染恒定表達Rep/Cap細胞系的方法以及AAV生產細胞系法，這些方法均操作繁瑣；目前最chang用的載體方法為Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)：將rAAV包裝組分AAV2的Rep基因序列、Cap基因序列、以及ITR-目的基因表達框的序列分別構建到三個桿狀病毒中，分別轉染昆蟲細胞Sf9各自擴增，然后通過共感染Sf9細胞來生產rAAV，該方法可以量產、成本低、操作簡單且不會對人體產生損傷。

AAV載體免疫原性極低，非常適合動物實驗，感染效率高，宿主范圍廣（分裂和不分裂細胞），不整合到基因組，穩(wěn)定表達持續(xù)時間長（半年以上），但是表達水平低且慢（細胞需要1周，動物需要2周），攜帶目的基因片段約為2kb。